叶绿素a、b难以洗脱下来应如何调整洗脱液

抽滤，混合液渗入后，胡萝卜素从吸附柱上全部排出，叶黄素与叶绿素a分开，并逐渐被洗脱下来。操作步骤
1．色素的提取
称取绿色组织2g，弃去粗大叶脉后剪成碎块，放在干净的研钵内，加入少量碳酸钙和石英砂，以及少量丙酮（干材料用85%丙酮，新鲜材料用无水丙酮），研磨成匀浆。减压过滤，滤液收集于量筒中，残渣再用丙酮洗涤数次，直至无色，定容20ml。提取液经反射光照射应观察到血红色荧光。
丙酮提取液中不仅有叶绿体的色素，而且也有能溶于丙酮中的化合物，为了更好地分离色素，必须用石油醚纯化色素。
纯化色素时将丙酮提取液转入分液漏斗中，加等量石油醚，轻轻摇动，再加等量饱和NaCl溶液振摇，再加等量蒸馏水振摇，放置分层。待明显分为两层，上层为深绿色石油醚层，有显著的荧光性。小心地把下面的丙酮水液层放掉，用洗瓶沿漏斗壁以水洗涤石油醚层6─7次，以彻底洗去丙酮。定容为20ml，所得石油醚色素提取液置于棕色瓶中待用。
2．吸附柱的制备
(1) 干法装柱
把层析柱的玻管部分固定在抽滤瓶上，在玻管的基部用清洁的脱脂棉填上，使松紧合适，于其上放一大小合适的圆形滤纸片，柱的上端放一小漏斗，取烘过的蔗糖粉由小漏斗装入柱中，边装边轻敲柱外壁，随后进行抽气，使蔗糖柱紧实，约为15cm长。
装好吸附剂后于其上轻轻盖上一片大小合适的圆形滤纸，小心地注入石油醚，抽滤，当蔗糖柱全部被石油醚浸湿，且在柱上面留有少量石油醚时，停止抽吸。
(2) 湿法装柱
层析柱用夹子垂直固定于铁架上，下端套上一段乳胶管，在乳管的另一端套上一玻璃管，在乳胶管上夹一螺旋夹，以控制流速。柱子下端同样填上脱脂棉，放上小滤纸片，柱上放一小漏斗。先关闭螺旋夹，注入一定体积的石油醚于柱中，打开螺旋夹，让石油醚以每秒1滴的流速流下，当注入的石油醚流至柱的3/4处，从小漏斗缓缓装入蔗糖粉，抽吸，并在蔗糖柱上盖一滤纸片，待石油醚快流完时，停止抽吸。
3．色素的分离
将色素提取液2ml倾入吸附柱上，当色素提取液将要全部进入蔗糖柱中，加入一定体积的石油醚冲洗，抽吸，至柱上的颜色快要扩展到吸附柱的下端时，就在柱上出现不同颜色的色带，上面是黄绿色的叶绿素b，其次是蓝绿色的叶绿素a，再下面是**的叶黄素，胡萝卜素没有被蔗糖吸附，出现在柱的最下端或随洗脱剂石油醚进入抽滤瓶中。
4．色素的洗脱
分布在柱上各色带的位置彼此很接近，为了更好地分离，需将各色带分开有较大的距离。
为此可加入10─15ml汽油—苯的混合液）（10∶1），抽滤，混合液渗入后，胡萝卜素从吸附柱上全部排出，叶黄素与叶绿素a分开，并逐渐被洗脱下来。这时再加入汽油—苯的混合液（1∶2），抽滤，叶绿a和叶绿素b更清楚地分开，叶绿素a被洗脱，叶绿素b可用乙醚（或乙醇）洗脱。
注：为了更好地观察叶绿体的4种主要色素，可在柱子的最下端装入中性氧化铝，约占柱长的1/5，上面再装蔗糖，制成吸附剂的混合柱，这样从上到下为叶绿素b，叶绿素a，叶黄素和胡罗卜素，4种色素会很好地分离。
回答于 2022-12-01
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纸层析法。色素在滤纸条上能分离的原因是四种色素随着层析液在滤纸上的扩散速度不同。四条色素带从上到下依次为胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a，叶绿素b。纸层析法依据极性相似相溶原理，是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂作为流动相。由于样品中各物质分配系数不同，因而扩散速度不同，从而达到分离的目的。试样经层析后可用比移值（Rf）表示各组成成分的位置（比移值=原点中心至色谱斑点中心的距离与原点中心至流动相前沿的距离之比），由于影响比移值的因素较多，因此一般采用在相同实验条件下对照物质对比以确定其异同。作为单体鉴别时，试样所显主色谱斑点的颜色（或荧光）与供置，应与对照（标准）样所显主色的谱斑点或供试品-对照品（1∶1）混合所显的主色谱斑点相同。作为质量指标（纯度）检查时，可取一定量的试样，经展开后，按各单体的规定，检视其所显杂质色谱斑点的个数或呈色（或荧光）的强