cDNA文库构建的方法与过程分别是什么?

cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合经典 cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆转录引物,或者用随机引物,给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头,连接到适当的载体中获得文库其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法,盐酸胍—有机溶剂法,热酚法等等,提取方法的选择主要根据不同的样品而定),要构建一个高质量的 cDNA 文库,获得高质量的 mRNA 是至关重要的,所以处理 mRNA 样品时必须仔细小心由于 RNA 酶存在所有的生物中,并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境,因此建立一个无 RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要在获得高质量的 mRNA 后,用反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链, cDNA 第2链的合成(用 RNA 酶 H 和大肠杆菌 DNA 聚合酶 I,同时包括使用 T4 噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌 DNA 连接酶进行的修复反应),合成接头的加入、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插入片断,扩增 cDNA 文库、对建立的 cDNA 文库进行鉴定这里强调的是对载体的选择,常规用的是 λ 噬菌体,这是因为 λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端,可用来构建柯斯质粒,这种质粒能容纳大片段的外源 DNA

cDNA双链合成

1 Superscipt II—RT合成第一链:

1 在一RNase-free的02ml PCR管中,加入

xul mRNA(大约500ng)

1ul Xho I Primer(14ug/ul)

(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)

11-x ul RNase-free water

（大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成）

2 混匀后,70℃反应10分钟;

3 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;

4 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:

4ul 5×first strand buffer

2ul 01M DTT

1ul 10mM dNTP(自己配制)

5 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;

6 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT,混匀;

7 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶

2 cDNA第二链的合成

1 第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):

20ul 10×DNA Polymerase I buffer

6ul 10mM dNTP(自己配制)

xul dd H2O

1ul RNase H(2U/ul)

10ul DNA Polymerase I(10U/ul)

总体系为200ul;

2 混匀后,16℃反应25小时;

3 70℃灭活10分钟;

4 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;

5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。

注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。

3 双链cDNA末端补平

1 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):

6ul 10mM dNTP

2ul T4 DNA Polymerase(87U/ul)

2ul BSA(10mg/ml)

2 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;

3 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;

4 离心后,吸取上清于另一15ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;

5 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH52)和25V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;

6 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;

7离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;

8离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味

注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。

PCR纯化试剂盒操作流程：

1．溶液PE使用前应加入适量体积95%－100%的乙醇，混匀。

2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。

3．加入spin column中，13000rpm离心1min。

4．加入075ml buffer PE，13000rpm离心1min。

5．13000rpm，再离心1min。

6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。

7．13000rpm离心2min。

8．加入30ul buffer EB，静置10min。

9．13000rpm离心2min。

10．加入1/10体积3M的NaAc，25倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。

4 EcoR I adaptor 加接

1 往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;

2 溶解完成后,顺序加入下列试剂:

12ul 10×Ligase Buffer

1ul 10mM rATP

1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul)

3 混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;

5 双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切

1 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase;

2 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:

1ul 10×Ligase Buffer

1ul 10mM rATP

6ul dd H2O

1ul T4 PNK(10U/ul)

3 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;

4 稍微离心使反应物集中至管底;

5 室温放置5分钟;然后加入下列试剂:

4ul Xho 10×Buffer

2ul BSA

5ul ddH2O

8ul Xho I (10U/ul)

6 37℃反应15小时,然后65℃灭活酶10分钟;

7 反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。

6胶回收cDNA

1．配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2ul EB/300ml 胶

2．取4℃保存样品上样，40ul/孔。

3．电泳50V；1hr

4．紫外灯下分别切下500~1kb、10-20kb及20-40kb cDNA 片段，分别放入已做标记的15ml离心管中。

5．称取胶重，加入三倍体积buffer QXI（例如，100mg胶中加入300ul buffer QXI）

6．50℃ 水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬，每管中加入5ul QIAEXII

7．50℃ 水浴10min，每隔2min 取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮

8．4℃，13000rpm，30sec。（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清）

9．加入500ul buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II 重悬

10． 离心并去上清（同操作8）

11． 加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，去上清

12． 再加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清

13． 超净台上吹干（至无乙醇味），加入10ul elution buffer，重悬QIAEX II，静置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。

14． 取1ul上清上样电泳，同时做分子量标准（1kb ladder）及DNA含量标准（10ng，20ng）作对照。

15． 将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。

注意事项：

1．胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。

2．胶回收时电压要稳定。 第一链的合成

oligo(dT)引导的DNA合成法:

利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第一链

缺 陷:

因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5'-末端,必须从3'-末端开始合成cDNA对于大分子量的较长的mRNA分子而言,特别麻烦

随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) :

根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始 第二链的合成

第一链的合成反应完成后，得到DNA/RNA杂交分子，在DNA聚合酶的作用下，以第一链为模版，合成cDNA的第二链。 变性降解除去杂交分子中的RNA,单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链

缺 点:

在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于mRNA 5'端的地方的序列出现缺失和重排 S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子

自身引导法合成双链cDNA 原 理:

以第一链合成产物cDNA:mRNA杂交体作为切口平移的模板,RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链

优点:a)合成cDNA的效率高

b)直接利用第一链的反应产物,不需纯化

c)避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA

3,引物-衔接头法

21世纪分子生物学研究方向及发展趋势

原定2005年完成人类基因组DNA测序的计划，已提前5年完成。当前，人类基因组研究的重点正在由“结构”向功能转移，一个以基因组功能研究为主要研究内容的“后基因组”(post-genomics)

时代已经到来。它的主要任务是研究细胞全部基因的表达图式和全部蛋白图式，或者说“从基

因组到蛋白质组”。于是，分子生物学研究的重点似乎又将回到蛋白质上来，生物信息学也应运而生。随着新世纪的到来，生命科学又将进入这样一个新时代。

一、功能基因组学

遗传学最近的定义是，对生物遗传的研究和对基因的研究。功能基因组学(functionalgenomics)

是依附于对DNA序列的了解，应用基因组学的知识和工具去了解影响发育和整个生物体的特定序列表达谱。以酿酒酵母(S cervisiae)为例，它的16条染色体的全部序列已于

1996年完成，基因组全长12086 kb，含有5885个可能编码蛋白质的基因，140个编码rRNA

基因，40个编码snRNA基因和275个tRNA基因，共计6340个基因。功能基因组学是进一步研究这6000多个基因，在一定条件下，譬如酵母孢子形成期，同时有多少基因协同表达才能完成这一发育过程，这就需要适应这一时期的全套基因表达谱(gene expression pattern)。要解决如此复杂的问题就必须在方法学上有重大的突破，创造出高效快速地同时测定基因组成千上万个基因活动的方法。目前用于检测分化细胞基因表达谱的方法，有基因表达连续分析法(serial analysis Of

gene expression，SAGE)、微阵列法(microarray)、有序差异显示(ordered differential display

，ODD)和DNA芯片(DNA chips)技术等。今后，随着功能基因组学的深入发展，将会有更新更

好的方法和技术出现。功能基因组亦包括了在测序后对基因功能的研究。酵母有许多功能重复的基因，常分布在染色体的两端，当酵母处于丰富培养基条件时，这些

基因似乎是多余的，但环境改变时就显示出其功能。基因丰余现象实际上是对环境的适应，丰余基因的存在为进化适应提供了可选择的余地。基因

组全序列还保留了基因组进化的遗迹，提示基因重复常发生在近中心粒区和染色体臂中段。

当前，研究者已把酵母基因组作为研究真核生物基因组功能的模式，计划建立酵母基因组6000多个基因的单突变体文库(single mutant library)，并可用于其它高等真核生物基因组之“基因功能作图”。

总之，功能基因组学的任务，是对成千上万的基因表达进行分析和比较，从基因组整体水平上阐述基因活动的规律。核心问题是基因组的多样

性和进化规律，基因组的表达及其调控，模式生物体基因组研究等。这门新学科的形成，是在后基因组时代生物学家的研究重点从揭示生命的所有

遗传信息转移到在整体水平上对生物功能研究的重要标志。

二、蛋白质组学

蛋白质组(proteome)对不少人来说，目前还是一个比较陌生的术语；它是在1994年由澳大利亚Macguarie大学的Wilkins等首先提出的，随后，得到国际生物学界的广泛承认。他们对蛋白质组的定义为：“蛋白质组指的是一个基因组所表达的全部蛋白质”(proteome indicates the proteins expressed by a genome)；“proteome”是由蛋白质一词的前几个字母"prote”和基因组一词的后几个字母"ome”拼接而成。

蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学。蛋白质组与基因组不同，基因组基本上是固定不变的，即同一生物不同细胞中基因组基本上是一样的，人类的基因总数约是32 000个。单从DNA序列尚不能回答某基因的表达时间、表达量、蛋白质翻

译后加工和修饰的情况，以及它们的亚细胞分布等。这些问题可望在蛋白质组研究中找到答案，因为蛋白质组是动态的，有它的时空性、可调节性，进而能够在细胞和生命有机体的整体水平上阐明生命现象的本质和活动规律。蛋白质组研究的数据与基因组数据的整合，亦会对功能基因组的研究发挥重要的作用。

蛋白质组由原定义一个基因组所表达的蛋白质，改为细胞内的全部蛋白质，比较更为全面而准确。但是，要获得如此完整的蛋白质组，在实践

中是难以办到的。因为蛋白质的种类和形态总是处在一个新陈代谢的动态过程中，随时发生着变化，难以测准。所以，1997年，Cordwell和Humphery-Smith提出了功能蛋白质组(functionalproteome)的概念，它指的是在特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表达蛋白质。与此同时，中国生物科学家提出了功能蛋白质组学(functional protemics)新概念，把研究定位在细胞内与某种功能有关或在某种条件下的一群蛋白质。功能蛋白质组只是总蛋白质组的一部分，通过对功能蛋白质组的研究，既能阐明某一群体蛋白质的功能，亦能丰富总蛋白质数据库，是从生物大分子(蛋白质、基因)水平到细胞水平研究的重要桥梁环节。

无论是蛋白质组学还是功能蛋白质组学，首先都要求分离亚细胞结构、细胞或组织等不同生命结构层次的蛋白质，获得蛋白质谱。为了尽可能分辨细胞或组织内所有蛋白质，目前一般采用高分辨率的双向凝胶电泳。一种正常细胞的双向电泳图谱通过扫描仪扫描并数字化，运用二维分析软

件可对数字化的图谱进行各种图像分析，包括分离蛋白在图谱上的定位，分离蛋白的计数、图谱间蛋白质差异表达的检测等。一种细胞或组织的蛋白质组双向电泳图，可得到几千甚至上万种蛋白质，为了适应这种大规模的蛋白质分析，质谱已成为蛋白质鉴定的核心技术。从质谱技术测得完整蛋白质的相对分子质量、肽质谱(或称肽质量指纹，pepetide massfingerprint)以及部分肽序列等数据，通过相应数据库的搜寻来鉴定蛋白质。此外，尚需对蛋白质翻译后修饰的类型和程度进行分析。在蛋白质组定性和定量分析的基础上建立蛋白质组数据库。

从提出蛋白质组的概念到现在短短几年中，已于1997年构建成第一个完整的蛋白质组数据库-酵母蛋白质数据库(yeast protein database，YPD)，进展速度极快，新的思路和技术不断涌现，蛋白质组学这门新兴学科，在今后的实践中将会不断完善，充实壮大，发展成为后基因组时代的带头学科。

三、生物信息学

HGP

大量序列信息的积累，导致了生物信息学(Bioinformatics)这门全新的学科的产生，对DNA和蛋白质序列资料中各种类型信息进行识别、存储、分析、模拟和转输。它常由数据库、计算机网络和应用软件三大部分组成。国际上现有4个大的生物信息中心，即美国生物工程信息中心(GenBank)和基因组序列数据库(GSDB)，欧洲分子生物学研究所(EMBL)和日本DNA数据库(DDBJ)。这些中心和全球的基因组研究实验室通过网站、电子邮件或者直接与服务器和数据库联系而获得的搜寻系统，使得研究者可以在多种不同的分析系统中对序列数据进行查询，利用和共享巨大的生物信息资源。

随着DNA大规模自动测序的迅猛发展，序列数据爆炸性地积累，HGP正式启动之时，就与信息科学和数据库技术同步发展，收集、存储、处理了庞大的数据，生物信息学逐步走向成熟，在基因组计划中发挥了不可取代的作用。建立的核苷酸数据库，已存有数百种生物的cDNA和基因组DNA序列的信息。在已应用的软件中，有DNA分析、基因图谱构建、RNA分析、多序列比较、同源序列检索、三维结构观察与演示、进化树生成与分析等。在蛋白质组计划中，由于蛋白质组随发育阶段和所处环境而变化，mRNA丰度与蛋白质的丰度不是显著相关，以及需要经受翻译后的修饰，因而对蛋白质的生物信息学研究，在内容上有许多特殊之处。现在建立的数据库，有蛋白质序列、蛋白质域、二维电泳、三维结构、翻译后修饰、代谢及相互作用等。而通用的软件，主要包括蛋白质质量+蛋白质序列标记、模拟酶解、翻译后修饰等。

当今的潮流是利用生物信息学研究基因产物——蛋白质的性质并估计基因的功能。

传统的基因组分析是利用一系列方法来得到连续的DNA

序列的信息，而蛋白质组连续系(proteomic cortigs)则源于多重相对分子质量和等电范围，由此来构建活细胞内全部蛋白质表达的图像。氨基酸序列与其基因的DNA

序列将被联系在一起，最终与蛋白质组联系在一起，从而允许人们研究不同条件下的细胞和组织。

http://wenkubaiducom/view/8a22e94669eae009581bec35html

看我整理了这么长时间，你就采纳了吧，亲。

是。根据查询中国知识网显示，rna反转录的cdna是单链的，最终形成双链，并且在合成单链cdna后，再用碱处理除去与其对应的rna，以单链cdna为模板，由依赖dna的dna聚合酶或依赖rna的dna聚合酶作用合成双链cdna，所以反转录的cdna是单链。反转录是进行基因工程过程中，以rna为模板提取出dna遗传信息的过程。

1

首先，你要知道那种细胞有该基因的高表达。

2

培养该细胞。

3

提取总的mRNA。

4

下面的步骤取决于你对该基因序列的知道情况。如果全序列已知，那就设计一对针对首尾的PCR引物，直接做RT-PCR，就可以得到全长cDNA了。如果只知道其中一段，那就先把mRNA用随机引物反转录为cDNA，建立cDNA文库。然后用已知的序列设计探针，在文库中寻找

CDS和cDNA之间的关键区别在于，CDS或编码序列是转录本中实际翻译成蛋白质的部分，为转录本

而cDNA序列是通过反转录从mRNA中衍生出来的DNA序列。cDNA是通过反转录从mRNA获得的DNA序列。为DNA序列

gtf文件中转录本的正负链：

+:代表转录本的位置是与基因组一样的

-：代表从与基因组上位置互补的一条链上转录出来的，其位置与基因组的位置要从数字更大的基因组坐标到数字更小的基因组坐标